Culture of rat mesenchymal stem cells on PHBV-PCL scaffolds: analysis of conditioned culture medium by FT-Raman spectroscopy / Cultivo de células-tronco mesenquimais de rato sobre arcabouços de PHBV-PCL: análise do meio de cultura condicionado por espectroscopia de FT-Raman

Abstract Mesenchymal stem cells (MSCs) have great potential for application in cell therapy and tissue engineering procedures because of their plasticity and capacity to differentiate into different cell types. Given the widespread use of MSCs, it is necessary to better understand some properties related to osteogenic differentiation, particularly those linked to biomaterials used in tissue engineering. The aim of this study was to develop an analysis method using FT-Raman spectroscopy for the identification and quantification of biochemical components present in conditioned culture media derived from MSCs with or without induction of osteogenic differentiation. All experiments were performed between passages 3 and 5. For this analysis, MSCs were cultured on scaffolds composed of bioresorbable poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) (PHBV) and poly(ε-caprolactone) (PCL) polymers. MSCs (GIBCO®) were inoculated onto the pure polymers and 75:25 PHBV/PCL blend (dense and porous samples). The plate itself was used as control. The cells were maintained in DMEM (with low glucose) containing GlutaMAX® and 10% FBS at 37oC with 5% CO2 for 21 days. The conditioned culture media were collected and analyzed to probe for functional groups, as well as possible molecular variations associated with cell differentiation and metabolism. The method permitted to identify functional groups of specific molecules in the conditioned medium such as cholesterol, phosphatidylinositol, triglycerides, beta-subunit polypeptides, amide regions and hydrogen bonds of proteins, in addition to DNA expression. In the present study, FT-Raman spectroscopy exhibited limited resolution since different molecules can express similar or even the same stretching vibrations, a fact that makes analysis difficult. There were no variations in the readings between the samples studied. In conclusion, FT-Raman spectroscopy did not meet expectations under the conditions studied.

Resumo As células-tronco mesenquimais (MSCs) possuem grande potencial para aplicação em procedimentos terapêuticos ligados a terapia celular e engenharia de tecidos, considerando-se a plasticidade e capacidade de formação em diferentes tipos celulares por elas. Dada a abrangência no emprego das MSCs, há necessidade de se compreender melhor algumas propriedades relacionadas à diferenciação osteogênica, particularmente liga à biomateriais usados em engenharia de tecidos. Este projeto objetiva o desenvolvimento de uma metodologia de análise empregando-se a FT-Raman para identificação e quantificação de componentes bioquímicos presentes em meios de cultura condicionados por MSCs, com ou sem indução à diferenciação osteogênica. Todos os experimentos foram realizados entre as passagens 3 e 5. Para essas análises, as MSCs foram cultivadas sobre arcabouços de polímeros biorreabsorvíveis de poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV) e o poli (ε-caprolactona) (PCL). As MSCs (GIBCO®) foram inoculadas nos polímeros puros e na mistura 75:25 de PHBV / PCL (amostras densas e porosas). As células foram mantidas em DMEM (com baixa glicose) contendo GlutaMAX® e 10% de SFB a 37oC com 5% de CO2 por 21 dias. A própria placa foi usada como controle. Os meios de cultura condicionados foram coletados e analisadas em FT-Raman para sondagem de grupos funcionais, bem como possíveis variações moleculares associadas com a diferenciação e metabolismo celular. Foi possível discernir grupos funcionais de moléculas específicas no meio condicionado, como colesterol, fosfatidilinositol, triglicerídeos, forma Beta de polipeptídeos, regiões de amida e ligações de hidrogênio de proteínas, além da expressão de DNA. Na presente avaliação, a FT-Raman apresentou como uma técnica de resolução limitada, uma vez que modos vibracionais de estiramento próximos ou mesmo iguais podem ser expressos por moléculas diferente, dificultando a análise. Não houve variações nas leituras entre as amostras estudadas, concluindo-se que a FT-Raman não atendeu às expectativas nas condições estudadas.

Culture of rat mesenchymal stem cells on PHBV-PCL scaffolds: analysis of conditioned culture medium by FT Raman spectroscopy / Cultivo de células-tronco mesenquimais de rato sobre arcabouços de PHBV-PCL: análise do meio de cultura condicionado por espectroscopia de FT-Raman

Mesenchymal stem cells (MSCs) have great potential for application in cell therapy and tissue engineering procedures because of their plasticity and capacity to differentiate into different cell types. Given the widespread use of MSCs, it is necessary to better understand some properties related to osteogenic differentiation, particularly those linked to biomaterials used in tissue engineering. The aim of this study was to develop an analysis method using FT-Raman spectroscopy for the identification and quantification of biochemical components present in conditioned culture media derived from MSCs with or without induction of osteogenic differentiation. All experiments were performed between passages 3 and 5. For this analysis, MSCs were cultured on scaffolds composed of bioresorbable poly(hydroxybutyrate co-hydroxyvalerate) (PHBV) and poly(ε-caprolactone) (PCL) polymers. MSCs (GIBCO®) were inoculated onto the pure polymers and 75:25 PHBV/PCL blend (dense and porous samples). The plate itself was used as control. The cells were maintained in DMEM (with low glucose) containing GlutaMAX® and 10% FBS at 37ºC with 5% CO2 for 21 days. The conditioned culture media were collected and analyzed to probe for functional groups, as well as possible molecular variations associated with cell differentiation and metabolism. The method permitted to identify functional groups of specific molecules in the conditioned medium such as cholesterol, phosphatidylinositol, triglycerides, beta-subunit polypeptides, amide regions and hydrogen bonds of proteins, in addition to DNA expression. In the present study, FT-Raman spectroscopy exhibited limited resolution since different molecules can express similar or even the same stretching vibrations, a fact that makes analysis difficult. There were no variations in the readings between the samples studied. In conclusion, FT-Raman spectroscopy did not meet expectations under the conditions studied.

As células-tronco mesenquimais (MSCs) possuem grande potencial para aplicação em procedimentos terapêuticos ligados a terapia celular e engenharia de tecidos, considerando-se a plasticidade e capacidade de formação em diferentes tipos celulares por elas. Dada a abrangência no emprego das MSCs, há necessidade de se compreender melhor algumas propriedades relacionadas à diferenciação osteogênica, particularmente liga à biomateriais usados em engenharia de tecidos. Este projeto objetiva o desenvolvimento de uma metodologia de análise empregando-se a FT-Raman para identificação e quantificação de componentes bioquímicos presentes em meios de cultura condicionados por MSCs, com ou sem indução à diferenciação osteogênica. Todos os experimentos foram realizados entre as passagens 3 e 5. Para essas análises, as MSCs foram cultivadas sobre arcabouços de polímeros biorreabsorvíveis de poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV) e o poli (ε-caprolactona) (PCL). As MSCs (GIBCO®) foram inoculadas nos polímeros puros e na mistura 75:25 de PHBV / PCL (amostras densas e porosas). As células foram mantidas em DMEM (com baixa glicose) contendo GlutaMAX® e 10% de SFB a 37oC com 5% de CO2 por 21 dias. A própria placa foi usada como controle. Os meios de cultura condicionados foram coletados e analisadas em FT-Raman para sondagem de grupos funcionais, bem como possíveis variações moleculares associadas com a diferenciação e metabolismo celular. Foi possível discernir grupos funcionais de moléculas específicas no meio condicionado, como colesterol, fosfatidilinositol, triglicerídeos, forma Beta de polipeptídeos, regiões de amida e ligações de hidrogênio de proteínas, além da expressão de DNA. Na presente avaliação, a FT-Raman apresentou como uma técnica de resolução limitada, uma vez que modos vibracionais de estiramento próximos ou mesmo iguais podem ser expressos por moléculas diferente, dificultando a [...].

Culture of rat mesenchymal stem cells on PHBV-PCL scaffolds: analysis of conditioned culture medium by FT-Raman spectroscopy

Abstract Mesenchymal stem cells (MSCs) have great potential for application in cell therapy and tissue engineering procedures because of their plasticity and capacity to differentiate into different cell types. Given the widespread use of MSCs, it is necessary to better understand some properties related to osteogenic differentiation, particularly those linked to biomaterials used in tissue engineering. The aim of this study was to develop an analysis method using FT-Raman spectroscopy for the identification and quantification of biochemical components present in conditioned culture media derived from MSCs with or without induction of osteogenic differentiation. All experiments were performed between passages 3 and 5. For this analysis, MSCs were cultured on scaffolds composed of bioresorbable poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) (PHBV) and poly(-caprolactone) (PCL) polymers. MSCs (GIBCO®) were inoculated onto the pure polymers and 75:25 PHBV/PCL blend (dense and porous samples). The plate itself was used as control. The cells were maintained in DMEM (with low glucose) containing GlutaMAX® and 10% FBS at 37oC with 5% CO2 for 21 days. The conditioned culture media were collected and analyzed to probe for functional groups, as well as possible molecular variations associated with cell differentiation and metabolism. The method permitted to identify functional groups of specific molecules in the conditioned medium such as cholesterol, phosphatidylinositol, triglycerides, beta-subunit polypeptides, amide regions and hydrogen bonds of proteins, in addition to DNA expression. In the present study, FT-Raman spectroscopy exhibited limited resolution since different molecules can express similar or even the same stretching vibrations, a fact that makes analysis difficult. There were no variations in the readings between the samples studied. In conclusion, FT-Raman spectroscopy did not meet expectations under the conditions studied.

Resumo As células-tronco mesenquimais (MSCs) possuem grande potencial para aplicação em procedimentos terapêuticos ligados a terapia celular e engenharia de tecidos, considerando-se a plasticidade e capacidade de formação em diferentes tipos celulares por elas. Dada a abrangência no emprego das MSCs, há necessidade de se compreender melhor algumas propriedades relacionadas à diferenciação osteogênica, particularmente liga à biomateriais usados em engenharia de tecidos. Este projeto objetiva o desenvolvimento de uma metodologia de análise empregando-se a FT-Raman para identificação e quantificação de componentes bioquímicos presentes em meios de cultura condicionados por MSCs, com ou sem indução à diferenciação osteogênica. Todos os experimentos foram realizados entre as passagens 3 e 5. Para essas análises, as MSCs foram cultivadas sobre arcabouços de polímeros biorreabsorvíveis de poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV) e o poli (-caprolactona) (PCL). As MSCs (GIBCO®) foram inoculadas nos polímeros puros e na mistura 75:25 de PHBV / PCL (amostras densas e porosas). As células foram mantidas em DMEM (com baixa glicose) contendo GlutaMAX® e 10% de SFB a 37oC com 5% de CO2 por 21 dias. A própria placa foi usada como controle. Os meios de cultura condicionados foram coletados e analisadas em FT-Raman para sondagem de grupos funcionais, bem como possíveis variações moleculares associadas com a diferenciação e metabolismo celular. Foi possível discernir grupos funcionais de moléculas específicas no meio condicionado, como colesterol, fosfatidilinositol, triglicerídeos, forma Beta de polipeptídeos, regiões de amida e ligações de hidrogênio de proteínas, além da expressão de DNA. Na presente avaliação, a FT-Raman apresentou como uma técnica de resolução limitada, uma vez que modos vibracionais de estiramento próximos ou mesmo iguais podem ser expressos por moléculas diferente, dificultando a análise. Não houve variações nas leituras entre as amostras estudadas, concluindo-se que a FT-Raman não atendeu às expectativas nas condições estudadas.

Potential effect of hyaluronic acid and triamcinolone acetate, alone or combined, on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells / Efecto potencial del ácido hialurónico y del acetato de triamcinolona solos o combinados sobre la diferenciación condrogénica de células-tronco mesenquimales / Efeito potencial do ácido hialurônico e triancinolona acetonida, isolados e combinados, na diferenciação condrogênica de células-tronco mensenquimais

Abstract Background: Osteoarthritis is a complex degenerative disease with several factors contributing to joint damage. Objective: To compare the potential effect of hyaluronic acid (HA) and triamcinolone acetonide (TA), alone or combined, on the in vitro chondrogenic differentiation process of mesenchymal stem cells (MSCs). Methods: MSCs were divided into four groups: Control, HA, TA, and HA/TA combined. Each treatment group was cultured for 14 days in chondrogenic differentiation medium. The chondrogenic differentiation potential was assessed by histology and immunohistochemistry. Results: The HA and HA/TA-treated MSCs presented histological characteristics similar to native chondrocytes. The extracellular matrix (ECM) of TA-treated MSCs was compact and organized. Glycosaminoglycan staining was intense in Control, moderate in TA, slight in HA/TA, and undetectable in HA. Type II collagen immunoreactivity was high in the TA-treated ECM and MSCs. Conclusions: Histological analysis shows that HA influences morphological development similar to chondrocytes of the MSCs, but with low expression of specific cartilage molecules. The TA promotes formation of a compact and organized ECM.

Resumen Antecedentes: La osteoartritis es una enfermedad degenerativa compleja en la cual varios factores contribuyen al daño articular. Objetivo: Comparar el efecto del ácido hialurónico (HA) y acetónido de triamcinolona (TA), solos o en combinación, en el proceso de diferenciación condrogénica in vitro de células madre mesenquimales (MSCs). Métodos: Las MSCs fueron divididas en cuatro grupos: Control, HA, TA y HA/TA, y cultivadas por 14 días en medio de diferenciación condrogénica para cada tratamiento. El potencial de diferenciación condrogénica fue analizado por medio de histología e inmunohistoquímica. Resultados: Las MSCs tratadas con HA y HA/TA, presentaron características histológicas similares a los condrocitos nativos, y la matriz extracelular (ECM) de MSCs tratadas con TA fue más compacta y organizada. La tinción de glicosaminoglicanos fue intensa en el Control, moderada en TA, ligera en HA/TA, y sin tinción en HA. La inmunoreactividad para colágeno tipo II fue más alta en las MSCs y ECM tratadas con TA. Conclusión: El análisis histológico muestra que el HA influencia un desarrollo morfológico similar a los condrocitos de las MSCs, pero con baja expresión de moléculas específicas de cartílago. La TA promueve la formación de una ECM compacta y organizada.

Resumo Antecedentes: A osteoartrite é uma doença degenerativa complexa, na qual vários fatores contribuem ao dano articular. Objetivo: Comparar o efeito do ácido hialurônico (HA) e Triancinolona acetonida (TA), só ou combinado no processo de diferenciação condrogênica in vitro de células tronco mesenquimais (MSCs). Métodos: MSCs foram divididas em 4 grupos: Controle, HA, TA y HA/TA e cultivadas por 14 dias com meio de diferenciação condrogênica e seus respectivos tratamentos. O potencial de diferenciação condrogênica foi acessado por meio de histologia e imunohistoquímica. Resultados: Histologicamente, MSCs tratadas com HA e HA/TA apresentaram características semelhantes de condrócitos nativos, e a matriz extracelular de MSCs tratadas com TA foi mais compacta e organizada. A coloração para glicosaminoglicanos foi intensa no Controle, moderada no TA, leve no HA/TA e sem coloração com HA. Para os grupos tratamento, a imunoreatividade para colágeno tipo II foi maior nas células e matriz extracelular tratadas com TA. Conclusão: Mediante análise histológica, o HA influenciou o desenvolvimento morfológico semelhante a condrócitos das MSCs, mas com baixa expressão de moléculas específicas de cartilagem. A TA promoveu a formação de uma matriz extracelular compacta e organizada.

Megacariopoyesis humana in vitro: determinación de la concentración óptima de trombopoyetina / In vitro human megacaryocytopoiesis: determination of thrombopoietin optimal concentration / Megacariópoiesis humana in vitro: determinação da concentração ótima da trombopoietina

El estudio de la megacariopoyesis humana se ha visto obstaculizado por la relativa escasez de megacariocitos en la médula ósea (0,05-0,2 % de las células medulares), lo que ha llevado a la optimización de protocolos de expansión in vitro a partir de precursores de diversos orígenes (cordón umbilical, médula ósea y sangre periférica con o sin movilización previa). Los cultivos celulares a partir de precursores han permitido la producción y el estudio tanto de megacariocitos así como de proplaquetas y plaquetas Sin embargo, la producción in vitro óptima de megacariocitos que culminen todos los estadios de diferenciación es un reto aún no resuelto. En este trabajo reportamos los hallazgos concernientes a la determinación de las condiciones y concentraciones de trombopoyetina para lograr una óptima relación entre la cantidad de trombopoyetina empleada y el porcentaje y grado de diferenciación megacariocítica en muestras obtenidas de cinco donantes alogénicos aceptados para trasplante de médula ósea.

The study of human megakaryocytopoiesis has been hampered by the relative scarcity of megakaryocytes in bone marrow (0.05-0.2 % of medullary cells), which has led to the optimization of protocols of in vitro expansion of precursors from diverse sources (umbilical cord, bone marrow and peripheral blood with or without previous mobilization). Cell cultures from different precursors have allowed the production and study of megakaryocytes as well as proplatelets and platelets. However, the in vitro production of megakaryocytes that culminate all stages of differentiation is a challenge that has not yet been resolved. In this work we report the findings related to the determination of thrombopoietin treatment conditions and concentrations to achieve an optimal relationship between the amount of thrombopoietin and the percentage and degree of megakaryocytic differentiation in five allogeneic donors that were accepted for bone marrow transplantation.

O estudo da megacariopoiese humana tem sido dificultado pela relativa escassez de megacariócitos na medula óssea (0,05-0,2 % das células medulares), o que levou à otimização dos protocolos de expansão in vitro a partir de precursores de diversas origens (cordão umbilical, medula óssea e sangue periférico com ou sem mobilização prévia). Culturas de células a partir de precursores permitiram a produção e o estudo tanto de megacariócitos e de proplaquetas e plaquetas. No entanto, a produção ótima in vitro de megacariócitos que culminam em todas as fases de diferenciação é um desafio ainda não resolvido. Neste trabalho, relatamos as descobertas relativas à determinação das condições e concentrações de trombopoietina para obter uma relação ótima entre a quantidade de trombopoietina usada e a taxa e o grau de diferenciação megacariocítica em amostras obtidas de cinco doadores alogênicos aceitos para transplante de medula óssea.

Immunophenotyping, plasticity tests and nanotagging of stem cells derived from adipose tissue of wild rodent agouti (Dasyprocta prymnolopha) / Imunofenotipagem, testes de plasticidade e marcação com nanocristais de céluas-tronco derivadas de tecido adiposo em cutias

There is a growing interest in the study of unspecialized mesenchymal stem cells, for there are still some discussions about their in vitro behavior. Regenerative medicine is a science undergoing improvement which develops treatments as cell therapy using somatic stem cells. In several studies, adipose tissue is presented as a source of multipotent adult cells that has several advantages over other tissue sources. This study aimed to characterize and evaluate the tagging of mesenchymal stem cells from the agoutis adipose tissue (Dasyprocta prymonolopha), with fluorescent intracytoplasmic nanocrystals. Fibroblast cells were observed, plastic adherent, with extended self-renewal, ability to form colonies, multipotency by differentiation into three lineages, population CD90 + and CD45 - expression, which issued high red fluorescence after the tagging with fluorescent nanocrystals by different paths and cryopreserved for future use. It is possible to conclude that mesenchymal stem cells from agouti adipose tissue have biological characteristics and in vitro behavior that demonstrate its potential for use in clinical tests.(AU)

Há um interesse crescente no estudo das células estaminais mesenquimais, não especializadas, pois ainda existem algumas discussões sobre seu comportamento in vitro. A medicina regenerativa é uma ciência em fase de crescimento que desenvolve tratamentos como terapia celular utilizando células estaminais somáticas. Em vários estudos, o tecido adiposo é apresentado como uma fonte de células adultas multipotentes que tem várias vantagens em relação a outras fontes de tecido. Este estudo teve como objetivo caracterizar e avaliar a marcação de células estaminais mesenquimais do tecido adiposo de cutias (Dasyprocta prymnolopha) com nanocristais intracitoplasmáticos fluorescentes. Observaram-se células fibroblásticas, aderentes ao plástico, com autorrenovação prolongada, capacidade de formar colônias, diferenciação em três linhagens, população CD90 + e expressão CD45, que emitiram alta fluorescência vermelha após a marcação com nanocristais fluorescentes por diferentes vias, e criopreservadas para uso futuro. É possível concluir que as células estaminais mesenquimais do tecido adiposo de cutias têm características biológicas e comportamentos in vitro que demonstram seu potencial para uso em testes clínicos.(AU)

Expressão gênica e proteica de membros da família HOX no câncer de mama luminal / Gene and protein expression of HOX family members in luminal breast cancer

Os genes homeobox são fatores de transcrição que regulam a expressão de múltiplos genes que influenciam o crescimento celular e fazem a mediação entre o epitélio e o estroma, regulando a diferenciação específica de cada tecido. Sua expressão é comumente desregulada em tumores, e estudos indicam que estes genes atuam como oncogenes, promovendo crescimento celular e invasão, ou como supressores tumorais, devido à sua atuação nos processos de morfogênese. No caso do câncer de mama, alguns genes homeobox tem expressão aumentada e outros, reduzida, e em geral não há ocorrência de mutações. Objetivos: Este trabalho procurou estudar a expressão de membros da família HOX em carcinomas luminais da mama, e correlacionar essa expressão com características clínico-patológicas, sobrevida global e livre de doença; avaliar a correlação entre a expressão de HOXA1 e Receptor de Progesterona; avaliar a correlação da expressão de HOXB7 e de MYC, bem como comparar os resultados da expressão gênica por imunohistoquímica e RT-qPCR. Métodos: Foram selecionados 260 pacientes com Carcinoma Mamário Luminal (CML) diagnosticados entre 2007 e 2010, 29 pacientes com amostras de CML congelados no Biobanco do AC Camargo Cancer Center, todos pareados com as respectivas amostras para imunohistoquímica, e 4 casos de tecido mamário normal congelado oriundos das pacientes doadoras de amostras de tumor congeladas. A expressão gênica foi pesquisada através dos métodos de imunohistoquímica e reação em cadeia da polimerase da transcrição reversa em tempo real. A técnica imunohistoquímica e os ensaios de expressão gênica foram realizados para os genes HOXA1, HOXA5, HOXA9, HOXB7, HOXB9, HOXB13, HOXC13 e HOXD3. Para a técnica de imunohistoquímica, o número de células positivas foi quantificado para cada marcador através do sistema de morfometria e escaneamento de lâminas Aperio ScanScope XT. A quantificação relativa de expressão gênica, na técnica de RT-qPCR foi realizada utilizando o software Sequence Detection System (Applied Biosystems), e calculada pelo modelo matemático descrito por Pfaffl. Todos os testes estatísticos foram realizados utilizando os softwares Excel (Microsoft 2011) e IBM SPSS, versão 24. Resultados: Houve associação com entre a expressão de HOXB7 e estadiamento patológico T ao diagnóstico (p=0,015) e entre a expressão de HOXC13 e estadiamento N ao diagnóstico (p=0,002; OR=2,61). Aumento da expressão de HOXA9 foi associado com redução da sobrevida global (p=0,031; RR: 2,331, IC95% [1,054-5,157], P=0,037). Não houve associação entre a expressão de HOXA1 e Receptor de Progesterona e/ou entre a expressão de HOXB7 e MYC. A correlação entre a expressão gênica por imunohistoquímica e RT-qPCR foi inexistente, negativa fraca ou positiva muito fraca. Conclusões: Aumento da expressão de HOXB7 é associado com pior estadiamento patológico T ao diagnóstico. Aumento da expressão de HOXC13 é associado com maior ocorrência de metástases linfonodais. Aumento da expressão de HOXA9 reduz a sobrevida global

Homeobox genes are transcription factors that regulate the expression of multiple genes which affect cell growth and make the mediation between the epithelium and the stroma, so regulating the differentiation of each specific tissue. Its expression is commonly deregulated in tumors, and studies indicate that these genes act as oncogenes, promoting cell growth and invasion, or act as tumor suppressors genes, due to its role in morphogenesis processes. In breast cancer, homeobox genes can have their increased or decreased expression, and generally there are no ocurrence of mutations. Objectives: This work aimed to study the expression of HOX family members in luminal carcinomas of the breast and to correlate this expression with clinical-pathological characteristics, global and disease-free survival; to evaluate the correlation between the expression of HOXA1 and Progesterone Receptor; to evaluate the correlation of HOXB7 and MYC expression, as well as to compare the results of the gene expression by immunohistochemistry and RT-qPCR. Methods: We selected 260 patients with Luminal Mammary Carcinoma (CML) diagnosed between 2007 and 2010, 29 patients with frozen CML samples in the AC Camargo Cancer Center Biobank, all paired with the respective samples for immunohistochemistry, and 4 cases of normal breast tissue frozen from donor patients with frozen tumor samples. Gene expression was investigated through the immunohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction in real time. Immunohistochemical technique and gene expression assays were performed for the genes HOXA1, HOXA5, HOXA9, HOXB7, HOXB9, HOXB13, HOXC13 and HOXD3. For the immunohistochemical technique, the number of positive cells was quantified for each marker through the morphometry and scanning system of Aperio ScanScope XT slides. The relative quantification of gene expression in the RT-qPCR technique was performed using the Sequence Detection System (Applied Biosystems) software, and calculated by the mathematical model described by Pfaffl. Results: There was an association between the expression of HOXB7 and pathological staging T at the diagnosis (p = 0.015) and between the expression of HOXC13 and staging N at diagnosis (p = 0.002, OR = 2.61). Increased expression of HOXA9 was associated with a reduction in overall survival (p = 0.031, RR = 2.331, 95% CI [1.054-5.157], P = 0.037). There was no association between the expression of HOXA1 and Progesterone Receptor and / or between the expression of HOXB7 and MYC. The correlation between the gene expression by immunohistochemistry and RT-qPCR was non-existent, negative negative or very weak positive. Conclusions: Increased expression of HOXB7 is associated with poorer T staging at diagnosis. Increased expression of HOXB13 is associated with increased occurrence of lymph node metastases. Increased expression of HOXA9 reduces overall survival

Increased expression levels of metalloprotease, tissue inhibitor of metalloprotease, metallothionein, and p63 in ectopic endometrium: an animal experimental study / Aumento nos níveis de expressão de metaloprotease, inibidor tecidual das metaloproteases, metalotioneina e p63 em endométrio ectópico: um estudo experimental animal

Abstract Objective To characterize the patterns of cell differentiation, proliferation, and tissue invasion in eutopic and ectopic endometrium of rabbits with induced endometriotic lesions via a well- known experimental model, 4 and 8 weeks after the endometrial implantation procedure. Methods Twenty-nine female New Zealand rabbits underwent laparotomy for endometriosis induction through the resection of one uterine horn, isolation of the endometrium, and fixation of tissue segment to the pelvic peritoneum. Two groups of animals (one with 14 animals, and the other with15) were sacrificed 4 and 8 weeks after endometriosis induction. The lesion was excised along with the opposite uterine horn for endometrial gland and stroma determination. Immunohistochemical reactions were performed in eutopic and ectopic endometrial tissues for analysis of the following markers: metalloprotease (MMP-9) and tissue inhibitor of metalloprotease (TIMP-2), which are involved in the invasive capacity of the endometrial tissue; and metallothionein (MT) and p63, which are involved in cell differentiation and proliferation. Results The intensity of the immunostaining for MMP9, TIMP-2, MT, and p63 was higher in ectopic endometria than in eutopic endometria. However, when the ectopic lesions were compared at 4 and 8 weeks, no significant difference was observed, with the exception of the marker p63, which was more evident after 8 weeks of evolution of the ectopic endometrial tissue. Conclusion Ectopic endometrial lesions seem to express greater power for cell differentiation and tissue invasion, compared with eutopic endometria, demonstrating a potentially invasive, progressive, and heterogeneous presentation of endometriosis.

Resumo Objetivo Caracterizar o padrão de diferenciação celular, proliferação e invasão tecidual em endométrio eutópico e ectópico de coelhas com lesões de endometriose induzidas por um modelo experimental 4 e 8 semanas após o procedimento de implantação endometrial. Métodos Vinte e nove coelhas fêmeas Nova Zelândia foram submetidas a laparotomia para indução de endometriose através da ressecção de um dos cornos uterinos, isolamento do endométrio e fixação do tecido no peritônio pélvico. Dois grupos de animais (14 animais em um grupo e 15 animais no outro) foram sacrificados 4 e 8 semanas após a indução da endometriose. A lesão foi excisada junto com o corno uterino contralateral para determinação da presença de glândulas e de estroma endometrial. Reações de imunohistoquímica foram realizadas no tecido endometrial eutópico e ectópico para análise dos seguintes marcadores: metaloprotease (MMP9) e inibidor tecidual da metaloprotease 2 (TIMP-2), os quais estão envolvidos na capacidade de invasão do tecido endometrial; e metalotioneina (MT) e p63, os quais estão envolvidos na diferenciação e proliferação celular. Resultados A intensidade da imunomarcação para MMP9, TIMP-2, MT e p63 foi mais alta nos endométrios ectópicos do que nos endométrios eutópicos. Contudo, quando as lesões foram comparadas entre 4 e 8 semanas, nenhuma diferença foi observada, com exceção do marcador p63, o qual foi mais evidente depois de 8 semanas de evolução do tecido endometrial ectópico. Conclusão Lesões endometriais ectópicas parecem expressar maior poder de diferenciação celular e de invasão tecidual comparadas com endométrios eutópicos, demonstrando o potencial de invasão, de progressão e de apresentação heterogênea da endometriose.

Regulation of muscle plasticity and trophism by fatty acids: A short review / Regulação da plasticidade e do trofismo muscular pelos ácidos graxos: uma breve revisão

Summary The skeletal muscle tissue has a remarkable ability to alter its plastic structural and functional properties after a harmful stimulus, regulating the expression of proteins in complex events such as muscle regeneration. In this context, considering that potential therapeutic agents have been widely studied, nutritional strategies have been investigated in order to improve the regenerative capacity of skeletal muscle. There is evidence of the modulatory action of fatty acids, such that oleic and linoleic acids, that are abundant in Western diets, on muscle function and trophism. Thus, fatty acids appear to be potential candidates to promote or impair the recovery of muscle mass and function during regeneration, since they modulate intracellular pathways that regulate myogenesis. This study is the first to describe and discuss the effect of fatty acids on muscle plasticity and trophism, with emphasis on skeletal muscle regeneration and in vitro differentiation of muscle cells.

Resumo O tecido muscular esquelético possui a notável capacidade plástica de alterar suas propriedades estruturais e funcionais após um estímulo lesivo, regulando a expressão de proteínas durante eventos complexos como a regeneração muscular. Nesse contexto, considerando que possíveis agentes terapêuticos vêm sendo amplamente estudados, estratégias nutricionais têm sido investigadas na perspectiva de melhorar a capacidade regenerativa do músculo esquelético. Há evidências da ação modulatória dos ácidos graxos, como os ácidos oleico e linoleico, que são abundantes nas dietas ocidentais, sobre a função muscular e o trofismo. Nesse sentido, os ácidos graxos parecem ser potenciais candidatos para promover ou prejudicar a recuperação da massa e a função muscular durante a regeneração, uma vez que modulam vias intracelulares reguladoras da miogênese. Este trabalho é o primeiro a descrever e discutir o efeito dos ácidos graxos sobre a plasticidade e o trofismo muscular, com ênfase na regeneração do músculo esquelético e na diferenciação de células musculares in vitro.

Avaliação do potencial osteogênico de células estromais da medula óssea de pacientes com escoliose / Evaluation of the osteogenic potential of bone marrow stromal cells isolated from scoliotic patients

Apesar de descrita há muitos anos em pacientes com escoliose idiopática do adolescente (EIA), a relação entre osteopenia e escoliose ainda é pouco compreendida. Mais recentemente, redução da densidade mineral óssea também foi relatada em associação com a escoliose congênita (EC). Estudos in vitro demonstraram que células estromais da medula óssea (BMSC) de pacientes com EIA apresentam diminuição na capacidade de diferenciação osteogênica e essa pode ser uma das razões pelas quais esses pacientes desenvolvem osteopenia e osteoporose. Apesar do relato da diminuição da massa óssea em pacientes com escoliose congênita (EC), não existem dados na literatura sobre a capacidade de diferenciação de BMSC desses pacientes. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial de formação óssea das BMSC de pacientes com EIA e EC, analisar sua frequência na medula óssea, sua capacidade proliferativa e o potencial de diferenciação in vitro e in vivo. BMSC foram isoladas de amostras ósseas de pacientes com EC e EIA, coletadas durante a cirurgia para correção da curvatura da coluna vertebral, e de indivíduos sem escoliose submetidos ao tratamento cirúrgico de fraturas esqueléticas. O teste de eficiência de formação de colônias mostrou frequência reduzida de BMSC isoladas de pacientes com EIA e também maior tempo de duplicação celular em relação às BMSC de pacientes com EC e controles sem escoliose. A avaliação dos marcadores de superfície CD34, CD45, CD73, CD90 e CD146 por citometria de fluxo demonstrou perfil fenotípico similar entre as BMSC dos três grupos (EC, EIA e controle). Quanto ao potencial de diferenciação in vitro, BMSC dos três grupos foram capazes de originar células das linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica. Os ensaios funcionais para avaliar o potencial de formação de tecido ósseo in vivo mostraram que as BMSC de EIA e as BMSC do grupo controle reproduziram a microarquitetura do tecido ósseo, recapitulando o microambiente da medula óssea. Embora os mecanismos celulares e moleculares que contribuem para a perda de massa óssea na EIA e EC ainda não estejam totalmente definidos, nossos resultados favorecem a hipótese de que deficiências quantitativas e qualitativas da população de BMSC possam estar implicadas, respectivamente, com a patogenia da EIA e da EC

Although reported for many years in patients with adolescent idiopathic scoliosis (AIS), the relationship between osteopenia e scoliosis is still poorly understood. Recently, decreased bone mineral density has also been described in congenital scoliosis (CS) patients. In vitro studies have shown that bone marrow stromal cells (BMSC) isolated from patients with EIA present reduced osteogenic differentiation capacity, which may be related to osteopenia. Despite reports of decreased bone mass in patients with congenital scoliosis (CS), there are no data in the literature on the differentiation potential of BMSC of those patients. Thus, the aim of this study was to evaluate the bone forming potential of BMSC of patients with AIS e CS, to analyze their frequency in the bone marrow, its proliferative capacity e the potential for differentiation in vitro e in vivo. BMSC were isolated from EC e EIA bone samples harvested during surgery for spine curvature correction, e from individuals without scoliosis submitted surgical treatment of skeletal trauma. Colony forming efficiency assay showed reduced frequency of BMSC isolated from patients with EIA e also a longer time of cell duplication compared to BMSC of patients with CS e control without scoliosis. The evaluation of the surface markers CD34, CD45, CD73, CD90, e CD146 by flow cytometry demonstrated similar phenotypic profile for BMSC from the three groups (EC, EIA e control). In relation to the potential to differentiate in vitro, BMSC from the three groups differentiated into osteogenic, chondrogenic e adipogenic lineages. Functional assays to evaluate the potential for bone tissue formation in vivo showed that BMSC from AIS e BMSC from control group reproduced the microarchitecture of bone tissue, recapitulating the microenvironment of the bone marrow. Although the cellular e molecular mechanisms contributing to bone mass loss in AIS e CS have not yet been fully established, our results favor the hypothesis that quantitative e qualitative impairment of BMSC population may be, respectively, implicated in the pathogenesis of osteopenia associated with AIS e CS

Isolation, expansion and differentiation of cellular progenitors obtained from dental pulp of agouti (Dasyprocta prymnolopha Wagler, 1831) / Isolamento, expansão e diferenciação de progenitors celulares obtidos da polpa dentária de cutia (Dasyprocta prymnolopha Wagler, 1831)

The study aimed to isolate, expand, differentiate and characterize progenitor cells existent in the dental pulp of agouti. The material was washed with PBS solution and dissociated mechanically with the aid of a scalpel blade on plates containing culture medium D-MEM/F-12, and incubated at 5% CO2-37⁰C. The growth curve, CFU assay, osteogenic/adipogenic differentiation and characterization were obtained from the isolation. The cells began to be released from the explant tissue around the 7th day of culture. By day 22 of culture, cells reached 80% confluence. At the UFC test, 81 colonies were counted with 12 days of cultivation. The growth curves before and after freezing showed a regular growth with intense proliferation and clonogenic potential. The cell differentiation showed formation of osteoblasts and fat in culture, starting at 15 days of culture in a specific medium. Flow cytometry (FACs) was as follows: CD34 (positive), CD14 (negative), CD45 (negative), CD73 (positive), CD79 (negative), CD90 (positive), CD105 (positive), demonstrating high specificity and commitment of isolated cells with mesenchymal stem cells strains. These results suggest the existence of a cell population of stem cells with mesenchymal features from the isolated tissue in the explants of agouti dental pulp, a potential model for study of stem cell strains obtained from the pulp tissue.

Isolation, expansion and differentiation of cellular progenitors obtained from dental pulp of agouti (Dasyprocta prymnolopha Wagler, 1831). Este estudo teve como objetivo isolar, expandir, diferenciar e caracterizar células progenitoras existentes na polpa dentária de cutia. O material foi lavado em solução de PBS e dissociado mecanicamente, com o auxílio de uma lâmina de bisturi, em placas contendo meio de cultura D-MEM/F-12, e incubadas em 5% de CO2-37⁰C. A curva de crescimento, o ensaio de CFU, a diferenciação osteogênica/adipogênica e a caracterização foram obtidas a partir do isolamento. As células começaram a ser liberadas, a partir do explante, em torno do sétimo dia de cultura. A partir do 22o dia, as células atingiram 80% de confluência. No teste para UFC, 81 colônias foram contadas aos 12 dias de cultivo. As curvas de crescimento pré- e pós-congelamento apresentaram crescimento regular, com intensa proliferação e potencial clonogênico. A diferenciação das células mostrou a formação de osteoblastos e de células de gordura, a partir de 15 dias de cultura em meio específico. A citometria de fluxo (FACS) apresentou-se como segue: CD34 (positivo), CD14 (negativo), CD45 (negativo), CD73 (positivo), CD79 (negativo), CD90 (positivo), CD105 (positivo), demonstrando a grande especificidade e comprometimento das células isoladas com linhagens de células-tronco mesenquimais. Estes resultados sugerem a existência de uma população de células-tronco mesenquimais isolada a partir de explantes da polpa dentária cutia, um modelo potencial para o estudo de linhagens de células-tronco obtidas a partir do tecido pulpar.

Association between human Papillomavirus and colorectal adenocarcinoma and its influence on tumor staging and degree of cell differentiation / Associação do Papilomavírus humano com o adenocarcinoma colorretal e sua influência no estadio tumoral e no grau de diferenciação celular

BACKGROUND: Colorectal cancer is one of the most common types of neoplasia among the worldwide adult population. Among neoplasms of the gastrointestinal tract, it is ranked second in relation to prevalence and mortality, but its etiology is only known in around 5% of the cases. It is believed that 15% of malignant diseases are related to viral oncogenesis. AIM: To correlate the presence of HPV with the staging and degree of cell differentiation among patients with colorectal adenocarcinoma. METHODS: A retrospective case-control study was conducted on 144 patients divided between a test group of 79 cases of colorectal cancer and a control group to analyze 144 patients aged 25 to 85 years (mean, 57.85 years; standard deviation, 15.27 years and median, 58 years). Eighty-six patients (59.7%) were male. For both groups, tissue samples from paraffin blocks were subjected to DNA extraction followed by the polymerase chain reaction using generic and specific primers for HPV 16 and 18. Dot blot hybridization was also performed with the aim of identifying HPV DNA. RESULTS: The groups were shown to be homogenous regarding sex, age and site of HPV findings in the samples analyzed. Out of the 41 patients with HPV, 36 (45.6%) were in the cases and five (7.7%) were in the control group (p<0.001). All the HPV cases observed comprised HPV 16, and HPV 18 was not shown in any of the cases studied. There were no significant differences in comparisons of sex, age and site regarding the presence of HPV in either of the groups. It was not observe any significant difference in relation to staging or degree of cell differentiation among the patients with colorectal cancer. CONCLUSION: Human papillomavirus type 16 is present in individuals with colorectal carcinoma. However, its presence was unrelated to staging or degree of differentiation. .

RACIONAL: O câncer colorretal é uma das neoplasias mais frequentes entre a população adulta mundial, e entre as do trato gastrointestinal, é a segunda em relação à prevalência e mortalidade sendo a sua causa conhecida apenas em cerca de 5% dos casos. Acredita-se que 15% das doenças malignas estariam relacionadas à oncogênese viral. OBJETIVO: Correlacionar a presença do HPV com o estadiamento e o grau de diferenciação celular dos pacientes portadores de adenocarcinoma colorretal. MÉTODOS: Foi realizado um estudo retrospectivo do tipo caso-controle com 144 pacientes divididos em um grupo teste representado por pacientes com câncer colorretal em um total de 79 casos e um grupo controle correspondente à pacientes com doença benigna totalizando 65 casos. Após a aplicação dos critérios de exclusão, foi possível analisar 144 pacientes com idade entre 25 a 85 anos (média de 57,85 anos com desvio-padrão de 15,27 anos e mediana de 58 anos). Oitenta e seis (59,7%) pacientes eram homens. Amostras teciduais a partir de blocos de parafina de ambos os grupos foram submetidos à extração do DNA e em seguida foi realizada reação em cadeia da polimerase com iniciadores genéricos e específicos para HPV 16 e 18 e também a hibridização do tipo dot blot com o intuito de identificar o DNA do HPV. RESULTADOS: Os grupos se mostraram homogêneos quanto a sexo, idade e localização do HPV nas amostras analisadas. Dos 41 pacientes com HPV, 36 (45,6%) eram do grupo teste e cinco (7,7%) do grupo controle (p<0,001). Todos os casos de HPV observados correspondiam ao HPV 16 não sendo evidenciado HPV 18 em nenhum caso estudado. Não houve diferença significativa na comparação realizada quando se considerou o sexo, idade e localização ...

Ultrassom terapêutico na atividade mitocondrial e diferenciação de células musculares C2C12 / Therapeutic ultrasound in the mitochondrial activity and differentiation of muscle cells C2C12

Introdução: O ultrassom terapêutico (US) é muito utilizado na prática clínica, mas há poucos estudos sobre seu efeito na regeneração muscular. Objetivo: Avaliar os efeitos do US sobre a atividade mitocondrial e diferenciação de células musculares C2C12, quando aplicado concomitantemente à indução do processo de diferenciação. Métodos: As células musculares foram submetidas ao processo de diferenciação pela adição de meio de cultura DMEM, suplementado com 2% de soro de cavalo, e receberam simultaneamente tratamento com US (pulsado a 20%, 3 MHz, 0,2 e 0,5 W/cm², 5 minutos). A atividade mitocondrial foi avaliada após 24h, 48h e 96h pelo método MTT, e a diferenciação celular após um e três dias pela atividade de creatina quinase (CK). Resultados: Não houve alteração da atividade mitocondrial e de CK nos grupos que receberam tratamento com US nos diferentes períodos avaliados. Conclusão: O US, nos parâmetros avaliados, não foi capaz de alterar a atividade mitocondrial e a diferenciação de células musculares C2C12.

Introduction: The therapeutic ultrasound (US) has been widely used in clinical practice, but there are few studies on its effect on muscle regeneration. Objective: To evaluate the effects of the US on mitochondrial activity and differentiation of muscle cells C2C12 when applied concomitantly the induction of the differentiation process. Methods: Muscle cells were subjected to differentiation process by addition of DMEM culture medium supplemented with 2% horse serum and received concomitant treatment with US (pulsed at 20%, 3 MHz, 0.2 and 0.5 W/cm², 5 minutes). The mitochondrial activity was assessed after 24, 48 and 96 hours by MTT assay and cell differentiation after one and three days for the activity of creatine kinase (CK). Results: There was no change in mitochondrial activity and CK in the groups receiving US treatment in different periods. Conclusion: In the evaluated parameters, the US was not able to change mitochondrial activity and differentiation of muscle cells C2C12.

Effects of nandrolone decanoate on the viability of muscle satellite cells during the differentiation process / Influencia del anabolizante decanoato de nandrolona en la viabilidad de las células satélites musculares en el proceso de diferenciación / Influência do anabolizante decanoato de nandrolona sobre a viabilidade de células satélites musculares em processo de diferenciação

Studies indicate that the anabolic nandrolone decanoate (Deca-Durabolin(r)) can modulate cell cycle regulation, but little is known about its effects on muscle cells. Anabolic steroids are used, especially by athletes, to improve muscle mass and performance in the practice of exercises. The aim of this study was to evaluate the effect of the anabolic Deca-Durabolin(r) on the proliferation of skeletal muscle precursor cells C2C12. Cells were grown in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), being supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (FBS) and subjected to differentiation by the addition of 2% horse serum. They were incubated with anabolic at concentrations of 5, 10, 25 and 50 µM. The groups that received no anabolic or vehicle served as controls. The viability (proliferation) was evaluated by the MTT method (3-[4,5-Dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue) after one, three and five days of incubation. Three independent experiments were performed in each of the mentioned conditions, and the results were submitted to statistical analysis with significance level of p≤0.05 (ANOVA/Dunnett). Results showed no difference in viability between muscle cells treated with anabolic and the control cultures in all parameters. In conclusion, nandrolone, at the used concentrations, was not able to alter the viability of muscle C2C12 satellite cells...

Se utilizan los anabolizantes, en particular por atletas con el objetivo de aumentar la masa muscular y mejoría del desempeño. Este estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto del anabolizante Deca- Durabolin(r) sobre la viabilidad (proliferación) de las células satélites musculares C2C12 inducidas a la diferenciación, imitando el proceso de reparación tras una lesión. Las células fueron cultivadas en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) y sometidas a diferenciación mediante la adición de 2% de suero de caballo y, simultáneamente, incubadas con el anabolizante en las concentraciones de 5 , 10 , 25 y 50 µM. En los grupos que no recibieron el anabolizante, ni el vehículo sirvió como controle . La viabilidad (proliferación) se evaluó después de uno, tres y cinco días, utilizando el método de MTT (3 - [4,5 - dimetiltriazol - 2 - il ] -2,5 difeniltetrazolio) . Se realizaron tres experimentos independientes, en cada condición citada, y los resultados sometidos al análisis estadístico con nivel de significación de p≤0,05% (ANOVA/Dunnett). Los resultados permitieron verificar que no hubo diferencia en la viabilidad entre células musculares tratadas con anabolizante e inducidas a diferenciación y culturas de controles que sólo fueron inducidas a diferenciación en todos los parámetros evaluados. En conclusión, el anabolizante decanoato de nandrolona, en las concentraciones evaluadas, no fue capaz de alterar la viabilidad de células musculares C2C12 durante el proceso de diferenciación...

Os anabolizantes são utilizados, especialmente por atletas, com o intuito de aumento da massa muscular e melhora do desempenho. Este estudo objetivou avaliar o efeito do anabolizante Deca-Durabolin(r) sobre a viabilidade (proliferação) de células satélites musculares C2C12 induzidas à diferenciação, mimetizando o processo de reparo após lesão. As células foram cultivadas em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) e submetidas à diferenciação pela adição de 2% de soro de cavalo e concomitantemente incubadas com o anabolizante nas concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM. Os grupos que não receberam o anabolizante nem o veículo serviram como controle. A viabilidade (proliferação) foi avaliada após um, três e cinco dias, utilizando o método de MTT (3-[4,5-dimetiltriazol-2-il]-2,5 difeniltetrazólio). Foram realizados três experimentos independentes, em cada condição citada, e os resultados submetidos à análise estatística com nível de significância de p≤0,05% (ANOVA/Dunnet). Os resultados permitiram verificar que não houve diferença na viabilidade entre células musculares tratadas com o anabolizante e induzidas à diferenciação e as culturas controles que somente foram induzidas à diferenciação, em todos os parâmetros avaliados. Em conclusão, o anabolizante decanoato de nandrolona, nas concentrações avaliadas, não foi capaz de alterar a viabilidade de células musculares C2C12 durante o processo de diferenciação...

Isolamento e caracterização de células-tronco obtidas de corações de camundongos adultos / Isolation and characterization of stem cells from hearts of adult mice

O uso de células-tronco representa uma alternativa para o tratamento das doenças que acometem o coração, devido à capacidade que essas células indiferenciadas têm de preservar sua própria população e de se diferenciar em células dos diversos tecidos, incluindo o cardíaco. Nesse trabalho comparamos as características de células-tronco isoladas a partir do tecido cardíaco e da medula óssea de camundongos transgênicos para a proteína fluorescente verde (GFP). As células-tronco cardíacas e da medula óssea apresentaram característica morfológica fibroblastóide e imunofenotípica de células-tronco mesenquimais, com alta expressão dos marcadores CD44, CD90, CD73, Sca-1 e baixa expressão dos marcadores de células hematopoiéticas. A análise citogenética revelou um cariótipo poliplóide a partir da terceira passagem das células-tronco isoladas do coração e da medula-óssea. A capacidade de diferenciação em vários tipos celulares, tais como adipócitos, osteócitos e condrócitos, também foi avaliada nas células-tronco de ambas as fontes. Tanto as células-tronco isoladas do coração como da medula óssea foram capazes de se diferenciar nessas três linhagens. Quando estimuladas com 5’azacitidina para testar o potencial cardiomiogênico das células isoladas do coração e da medula óssea, apenas as células-tronco cardíacas passaram a expressar alguns marcadores de cardiomiócitos, tais como troponina T cardíaca e GATA-4...

Stem cells are undifferentiated cells with the ability of self-renewal and differentiation into different cell types, with the potential to treat heart diseases. In the present study we compared the characteristics of stem cells isolated from the heart to bone marrow stem cells, both obtained from EGFP transgeneic mice. Cardiac and bone marrow stem cells presented fibroblastic morphology and an immunophenotype compatible with mesenchymal stem cells – high expression of CD44, CD90, CD73, Sca-1 and low expression of of hematopoietic lineage markers. Cytogenetic analysis demonstrated polyploid karyotypes after the third passage of the stem cells isolated from heart and bone marrow. Both bone marrow and heart stem cells were able to differentiate into adipocytes, osteocytes and chondrocytes. In order to test the potential of differentiation into cardiomyocytes, cells were stimulated with 5’azacytidine and only cardiac stem cells expressed heart-specific markers: cardiac T troponin and GATA-4...

Ganglioglial differentiation in a medulloblastoma with extensive nodularity / Diferenciação ganglioglial em um meduloblastoma com extensa nodularidade

We report the case of a 2 month-old patient with a large, probably congenital, posterior fossa tumor. Hematoxylin and eosin staining (HE), reticulin and immunohistochemistry revealed a medulloblastoma with extensive nodularity, showing ganglioglial differentiation, high proliferative index in the primitive neuroectodermal tumor (PNET) area and low proliferative index in the ganglioglial maturation area. Ganglioglial differentiation is a rare event in medulloblastomas and its mechanism is still unknown. Previous surgery, radiation and chemotherapy may contribute to differentiation in astrocytic and nerve cells. In this case, however, the differentiation was already present in the first specimen, prior to any surgical or therapeutic procedure.

Paciente de dois meses de idade apresentando grande tumor, provavelmente congênito, de fossa posterior. As colorações de hematoxilina e eosina (HE), reticulina e imuno-histoquímica revelaram meduloblastoma com extensa nodularidade, exibindo diferenciação ganglioglial, alto índice proliferativo na região de tumor neuroectodérmico primitivo e baixo índice proliferativo na área de maturação ganglioglial. Diferenciação ganglioglial é um evento raro em meduloblastomas e seu mecanismo ainda é desconhecido. Cirurgia prévia, radiação e quimioterapia podem contribuir para diferenciação em células astrocitárias e nervosas. Neste caso, entretanto, a diferenciação já estava presente no primeiro espécime, antes de cirurgias prévias ou procedimentos terapêuticos.

Isolamento e caracterização de células mesenquimais do tecido adiposo de cães / Isolation and characterization of canine adipose-derived mesenchymal stem cells

As células-tronco mesenquimais (CTMs) diferenciam-se em várias linhagens e têm potencial de utilização na medicina regenerativa. As CTMs podem ser isoladas de vários tecidos de animais adultos. O objetivo deste estudo foi o isolamento das CTMs do tecido adiposo de cães, seu cultivo e diferenciação. Foram coletadas amostras de tecido adiposo subcutâneo de cinco cães. As CTMs foram isoladas, obtendo-se 146.803 (±49.533) células/g, cultivadas e diferenciadas em osteoblastos, adipócitos e condrócitos. Avaliaram-se a cinética do crescimento, a morfologia e a viabilidade celular. A caracterização citoquímica comprovou a natureza mesenquimal das células isoladas. O cultivo foi iniciado com 20.000 células/mL, verificando-se crescimento rápido até 72 horas (220.000 células/mL), fase exponencial entre 72 e 192 horas (455.000 células/mL), seguida de platô por saturação da densidade com 240 horas (355.000 células/mL). A viabilidade celular variou entre 96 e 100%. As CTMs em cultivo são fibroblásticas, fusiformes, com citoplasma basofílico e núcleo esférico. O comprimento médio das células variou entre 80,85 e 98,36µm, a largura média entre 17,40 e 28,79µm e o diâmetro médio do núcleo entre 15,46 e 17,74µm.

The applications of mesenchymal stem cells (MSCs) are becoming increasingly more promising for regenerative medicine and tissue engineering fields. MSCs can be isolated from adult animals from a variety of tissues, such as the adipose. This study focused on the isolation, culture and differentiation of MSCs from canine adipose tissue. Samples of subcutaneous adipose tissue from five dogs were collected. These cells were isolated, cultured and differentiated into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes. We obtained 146,803 (±49,533) cells/g. Growth kinetics and viability studies were conducted during cell culture and the evaluation of cell differentiation was successfully performed by cytochemistry. The cell cultures were initiated with 20,000 MSCs/ml. Rapid growth was observed at 72 hours (220,000 cells/ml), the exponential phase between 72 and 192 hours (455,000 cells/ml) and saturation at 240 hours (355,000 cells/ml). The cellular viability ranged from 96 to 100%. MSCs in culture are fibroblastic cells, fusiform with basophilic cytoplasm and spherical nucleus. The length and width means of the cells and nuclear diameter ranged from 80.85-98.36µm, 17.40-28.79µm and 15.46-17.74µm respectively.

Avaliação molecular e fenotípica da superexpressão e do silenciamento de MEF2C em miócitos cardíacos / Phenotypic and molecular evaluation of overexpression and silencing of MEF2C in cardiac myocytes

Os fatores MEF2 (Myocyte Enhancer Factor 2) pertencem à família MADS Box (MCM1-Agamous-Deficiens-Serum response factor) e foram descritos pela primeira vez como fatores de transcrição que se ligam a sequencias de DNA ricas em A/T nos promotores de vários genes músculo específicos. Existem 4 genes da família MEF2 que foram identificados em vertebrados: MEF2A, B, C e D que são expressos de forma distinta durante a embriogênese e nos tecidos adultos. Estudos anteriores do nosso laboratório demonstraram que o fator de transcrição MEF2 é ativado por estiramento mecânico e influencia a expressão de genes relacionados à hipertrofia cardíaca. Utilizando a tecnologia de siRNA para MEF2C (siRNAMEF2C) demonstramos a atenuação da hipertrofia cardíaca induzida por coarctação da aorta nos animais que receberam o siRNAMEF2C. Por outro lado trabalhos demonstraram que animais transgênicos com a superexpressão de MEF2A ou de MEF2C e submetidos à sobrecarga de pressão por coarctação da aorta, não apresentam hipertrofia cardíaca compensatória. Nesses animais a superexpressão de MEF2A ou de MEF2C no coração está associada à deterioração cardíaca funcional e estrutural e o desenvolvimento de cardiomiopatia dilatada. Contudo, a caracterização fenotípica e os mecanismos moleculares envolvidos na superexpressão de MEF2C em miócitos cardíacos ainda são desconhecidos. Da mesma forma não é conhecido o papel do fator de transcrição MEF2C na resposta hipertrófica do miócito cardíaco após coarctação da aorta. No presente trabalho foi demonstrado que a superexpressão de MEF2C em miócitos cardíacos de ratos neonatos (NRMV), com o uso de partículas adenovirais, induziu a desdiferenciação celular e a ativação de mecanismos envolvidos na progressão do ciclo celular. Esses resultados foram obtidos por meio de experimentos de microarranjo de DNA, proteoma, PCR em tempo real e western blotting...

The factors MEF2 (myocyte enhancer factor 2) belong to the family MADS box (MCM1-Agamous-deficiens-Serum response factor) and were first described as transcription factors that bind DNA sequences rich in A / T in the promoters of multiple muscle-specific genes. There are four MEF2 family genes that were identified in vertebrates MEF2A, B, C and D are expressed differently during embryogenesis and in adult tissues. Previous studies from our laboratory demonstrated that the transcription factor MEF2 is activated by mechanical stretch and influences the expression of genes related to cardiac hypertrophy. Using siRNA technology to MEF2C (siRNAMEF2C) demonstrated attenuation of cardiac hypertrophy induced by aortic coarctation in animals that received siRNAMEF2C. On the other hand studies have demonstrated that transgenic mice with overexpression of MEF2A or MEF2C and subjected to pressure overload by aortic coarctation show no compensatory cardiac hypertrophy. In these animals the overexpression of MEF2A or MEF2C in the heart is associated with structural and functional cardiac deterioration and development of dilated cardiomyopathy. However, the phenotypic and molecular mechanisms involved in the overexpression of MEF2C in cardiac myocytes are still unknown. Likewise, there is known the role of the transcription factor MEF2C in cardiac myocyte hypertrophic response after aortic coarctation. In the present study it was shown that overexpression of MEF2C in neonatal rat cardiac myocytes (NRMV) with the use of adenoviral particles, and cellular dedifferentiation induced activation mechanisms involved in cell cycle progression. These results were obtained by DNA microarray experiments, proteomics, real time PCR and western blotting...

Diferenciação de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo em cardiomiócitos / Differentiation of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells into cardiomyocytes

FUNDAMENTO: O potencial de renovação e proliferação dos cardiomiócitos, in vivo, é pequeno, e por isso, o músculo cardíaco apresenta limitada capacidade de repor células perdidas. Na tentativa de minimizar os danos oriundos de lesões hipóxico-isquêmicas e daquelas que acometem o sistema de condução do coração, a terapia celular com células-tronco mesenquimais (MSC) vem sendo utilizada, inclusive com cardiomiócitos diferenciados a partir de MSC. OBJETIVO: O presente trabalho comparou três protocolos distintos de indução de diferenciação objetivando a sugestão de um método viável para a diferenciação de maior número de células funcionais que expressem fenótipo cardiomiogênico. MÉTODOS: Culturas de MSC obtidas de tecido adiposo de ratos jovens da linhagem Lewis transgênicos para proteína verde fluorescente (GFP) foram submetidos a três diferentes meios de diferenciação cardiogênica: Planat-Bérnard, 5-azacitidina e meio Planat-Bérnard + 5-azacitidina e observadas quanto a expressão de marcadores celulares cardíacos. RESULTADOS: Nos três protolocos utilizados observou-se formação da proteína alfa-actinina sarcomérica no citoesqueleto das células submetidas à diferenciação, expressão de conexina 43 na membrana nuclear e citoplasmática e formação de gap junctions, necessárias para a propagação do impulso elétrico no miocárdio, contudo, em nenhum protocolo foi observada contração espontânea das células submetidas à diferenciação cardiogênica. CONCLUSÃO: A indução com 5-azacitidina proporcionou diferenciação celular cadiomiogênica efetiva e similar à encontrada com o meio Planat-Bénard e, por ser um protocolo mais simples, rápido e com menor custo torna-se o método de eleição.

BACKGROUND: Cardiomyocytes have small potential for renovation and proliferation in vivo. Consequently, the heart muscle has limited capacity of self-renewal. Mesenchymal stem cells (MSC) therapy, as well as MSC differentiated into cardiomyocytes, has been used in the attempt to minimize the effects of ischemic-hypoxic lesions and those affecting the electrical conduction system of the heart. OBJECTIVE: The present study compared three distinct protocols for induced differentiation of MSC into cardiomyocytes aimed at finding a viable method for producing a large number of functional cells expressing cardiomyogenic phenotype. METHODS: Mesenchymal stem cells were obtained from the adipose tissue of young transgenic Lewis rats expressing green fluorescent protein (GFP), and submitted to three distinct differentiation-inducing media: 1) Planat-Bérnard, 2) 5-azacytidine, and 3) Planat-Bérnard + 5-azacytidine; further, these cells were identified based on the expression of cardiac cell markers. RESULTS: All three protocols detected the expression of sarcomeric-alpha-actinin protein in the exoskeleton of cells, expression of connexin-43 in the nuclear and cytoplasmic membrane, and formation of gap junctions, which are necessary for electrical impulse propagation in the myocardium. However, no spontaneous cell contraction was observed with any of the tested protocols. CONCLUSION: Induction with 5-azacytidine provided an effective cadiomyogenic cellular differentiation similar to that obtained with Planat-Bénard media. Therefore, 5-azacytidine was the method of choice for being the simplest, fastest and lowest-cost protocol for cell differentiation.

In vitro effects of caffeine in growth cartilage of rats / Efeitos in vitro da cafeína na cartilagem de crescimento de ratos

OBJETIVO: Avaliar os efeitos in vitro da cafeína na proliferação, apoptose e expressão de transcriptos gênicos de diferenciação condrogênica na cartilagem de crescimento.MÉTODO: As epífises cartilaginosas de fêmures de ratos neonatos foram divididas em dois subgrupos: os tratados com cafeína e o grupo controle, ambos observados nos tempos de 0, 7, 14 e 21 dias. As epífises cartilaginosas de fêmures de cada subgrupo e de cada tempo foram submetidas à histomorfometria, análise imunoistoquímica, técnica de túnel e RT-PCR em tempo real.RESULTADO: A diminuição da atividade proliferativa e o aumento de condroblastos em apoptose aos 21 dias foram encontrados em ambos os subgrupos. Entretanto a diminuição da proliferação celular causada pela cafeína foi menor quando comparada ao grupo controle e aumentou significativamente a expressão de transcriptos gênicos para diferenciação condrogênica, representada pelo SOX-9 e pelo RUNX-2. Entretanto o cultivo in vitro com cafeína demostrou efeitos antagônicos: apesar dos efeitos positivos na proliferação e diferenciação de condroblatos, cafeína aumentou a apoptose, caracterizada pelo aumento da expressão de caspase-3 e do numero de células em apoptose (p< 0.05).CONCLUSÃO: A cafeína apresenta efeitos antagônicos in vitro na cartilagem em crescimento, aumentando a proliferação, diferenciação e apoptose celular. Estudo experimental.

OBJECTIVE: To evaluate the in vitro effetcs of caffeine on proliferation, apoptosis and gene transcripts expression of chondrogenic differentiation in growth cartilage.METHODS: The cartilaginous epiphyses of femurs of newborn rats, which were divided into two subgroups: treated with caffeine and control group, both observed over the time periods of 0, 7, 14 and 21 days. The cartilaginous epiphyses of femurs of each subgroup and each time span were subjected to histomorphometric, immunohistochemical analysis, Tunel technique and RT-PCR in real time.RESULTS: The decrease in proliferative activity and the increase of apoptotic chondroblasts at 21 days were found regardless of the subgroup. However, the decrease in cell proliferation caused by caffeine was lower than in the control group and significantly increased the expression of gene transcripts for chondrogenic differentiation, represented by SOX-9 and RUNX-2. However, the in vitro culture with caffeine revealed antagonistic effects: despite the positive effect on chondroblasts proliferation and differentiation, caffeine increased apoptosis, characterized by increased expression of caspase 3 and of the number of cells undergoing apoptosis (p<0.05).CONCLUSION: Caffeine presents antagonistic effects in vitro on growth cartilage, increasing the proliferation, differentiation and cell apoptosis. Experimental Study.